質(zhì)粒線性化階段使用限制性內(nèi)切酶將超螺旋的質(zhì)粒DNA線性化，避免體外轉(zhuǎn)錄時(shí)T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄環(huán)形的質(zhì)粒DNA目標(biāo)序列下游序列，從而產(chǎn)生長(zhǎng)度不一的產(chǎn)物。

此步驟中原料質(zhì)粒DNA的質(zhì)量、線性化條件（質(zhì)粒濃度，酶濃度，溫度，孵育時(shí)間等）會(huì)影響線性化質(zhì)粒的質(zhì)量屬性，繼而影響體外轉(zhuǎn)錄的mRNA質(zhì)量。

線性化質(zhì)粒純化需要去除的雜質(zhì)主要是未酶切完全的質(zhì)粒、以及酶切工藝引入的酶。通常使用疏水、反相及質(zhì)粒親和層析可以有效分離線性化和超螺旋質(zhì)粒，并可去除酶。通過優(yōu)化酶切工藝，可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的完全線性化，只需要去除限制性內(nèi)切酶即可。在此條件下，多模式層析（Coll系列）和陰離子交換也可以滿足工藝的要求。

完成純化后，線性化質(zhì)粒通過切向流超濾完成緩沖液置換和濃縮，達(dá)到體外轉(zhuǎn)錄的要求。線性化質(zhì)?？梢阅褪茌^高的剪切力，可以選用膜包和中空纖維。需要注意線性化后質(zhì)粒，更易穿過膜上的截留孔，需要選擇更小截留分子量的濾器，以保證收率。

體外轉(zhuǎn)錄將核苷酸原料在T7 RNA聚合酶作用下合成為mRNA，此后使用DNA酶消化去除模板DNA。廣泛采用的共轉(zhuǎn)錄加帽也在此階段完成。轉(zhuǎn)錄后加帽工藝則需要進(jìn)行mRNA純化、超濾換液后，再進(jìn)行酶催化加帽。體外轉(zhuǎn)錄后純化需要去除的雜質(zhì)主要是工藝中所添加的蛋白（T7聚合酶、焦磷酸酶、DNA酶、RNA酶抑制劑等）和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)（dsRNA和截?cái)嗟腞NA片段）。蛋白類雜質(zhì)與RNA性質(zhì)差異較大，較容易去除；產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)會(huì)降低翻譯效率，并具有免疫原性，且與目的mRNA性質(zhì)接近，是純化工藝的主要挑戰(zhàn)。

體外轉(zhuǎn)錄的原料及條件不僅決定mRNA的產(chǎn)率，也影響產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的水平。RNA分子序列設(shè)計(jì)、不同廠家T7 RNA聚合酶選擇和用量、線性化質(zhì)粒模板濃度、反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)和反應(yīng)溫度、反應(yīng)緩沖液成分尤其是鎂離子濃度等都是體外轉(zhuǎn)錄需要優(yōu)化的因素。其中酶是該工藝的關(guān)鍵因素之一，不同來源的酶轉(zhuǎn)錄后mRNA產(chǎn)量和dsRNA含量可能有較大的差異。除上述提及的因素外，在緩沖溶液中加入適量的尿素等試劑也有助于降低dsRNA的含量。

工藝放大后與實(shí)驗(yàn)室工藝最大的區(qū)別在于反應(yīng)容器的差異及由此帶來的溫度控制的精度。實(shí)驗(yàn)室條件摸索時(shí)小于1ml體系通常使用PCR儀或金屬浴保溫，1ml至幾十ml體系通常使用水浴鍋或恒溫?fù)u床等。不同的保溫方式，反應(yīng)體系的溫度精度及體系中溫度分布也不同，在工藝放大中通常會(huì)影響工藝表現(xiàn)。

GMP生產(chǎn)中通常選用一次性無核酸酶袋作為容器，溫控設(shè)備可以使用搖擺式生物反應(yīng)器、攪拌式生物反應(yīng)器或一次性配液系統(tǒng)，但不同方式溫控效果存在差異，升溫降溫速率等參數(shù)的設(shè)置也需調(diào)整以保證體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的表現(xiàn)。

原液生產(chǎn)中的純化工藝，由體外轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)品質(zhì)量水平及目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)決定。目前已知的純化工藝存在較大的差別，但主要是層析及超濾的組合。比如BioNTech選擇使用蛋白酶K降解體外轉(zhuǎn)錄中加入的酶，僅通過兩步切向流過濾就完成純化。Moderna則使用親和層析和離子交換層析進(jìn)行純化，最后使用超濾洗濾進(jìn)行濃縮換液。