RNA 疫苗生產(chǎn)關(guān)鍵：質(zhì)粒下游純化工藝路線與優(yōu)化策略

mRNA是細(xì)胞內(nèi)一種重要的分子，它攜帶從DNA轉(zhuǎn)錄來的遺傳信息，并指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是疫苗開發(fā)和基因治療中，mRNA技術(shù)有著舉足輕重的作用和巨大的市場潛力。

mRNA類疫苗的制備工藝包括了質(zhì)粒DNA（pDNA）模板的制備、pDNA線性化、體外轉(zhuǎn)錄（IVT）并純化、mRNA的納米脂質(zhì)顆粒（LNP）包封,最后經(jīng)制劑和凍干，得到mRNA類疫苗產(chǎn)品。在全球供應(yīng)鏈不確定性和地緣政治風(fēng)險加劇的背景下，百林科可提供成熟的上下游全流程解決方案。

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圖1. mRNA完整工藝流程

質(zhì)粒DNA（pDNA）純化

質(zhì)粒DNA為制備mRNA的原料，其制備工藝較為成熟，可選擇經(jīng)典三步法和改進兩步法工藝。三步法具有操作簡單、平臺適用性強等優(yōu)點，而兩步法具有工藝時間短、易放大、成本低等優(yōu)點。

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圖2. 質(zhì)粒純化解決方案

經(jīng)典三步法首先是裂解步驟，pDNA一般使用堿裂解步驟，此步可選擇性地沉淀染色體DNA和其他大分子雜質(zhì)。常用菌體重懸溶液：50mM Tris-HCl,10mM EDTA-2Na,50mM glucose, pH8.0。常用的裂解溶液：0.2M NaOH,1%SDS。常用的中和溶液：3M KAc, 5M HAc。其中菌體重懸濃度、裂解時間、中和液比例為關(guān)鍵工藝參數(shù)。重懸濃度過高可能會導(dǎo)致菌體裂解不充分，過低會增加后續(xù)步驟體積，增加成本。裂解時間過短或不合適的裂解方式可能使裂解不充分，收率偏低，時間過長可能會增加開環(huán)比例降低超螺旋質(zhì)粒質(zhì)量。各因素間存在相互交互作用，必要時設(shè)計DOE實驗，確定最佳工藝參數(shù)。

第二步為澄清，堿裂解中和后呈蛋花狀，必要時可加入一定量的碳酸氫銨或碳酸氫鈉使其固液分離，再使用深層過濾或離心澄清。

第三步為UF/DF，此步目的是除去部分RNA、HCP、色素等雜質(zhì)，減少體積，降低層析步驟的負(fù)荷。可選擇超濾膜包和中空纖維完成濃縮和洗濾，較為脆弱的質(zhì)粒可選用中空纖維，相比于超濾膜包有較低的剪切力。超濾載量、剪切力、濃縮倍數(shù)、跨膜壓力為關(guān)鍵工藝參數(shù)。應(yīng)注意避免濃縮倍數(shù)過高引發(fā)聚集，避免剪切力過大導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降。超濾膜包/中空纖維可按圖示標(biāo)準(zhǔn)選膜。UF/DF階段可選用百林科TFFNOVA^? 系列中空纖維搭配FiltraLinX^? Pilot 超濾系統(tǒng)，百林科TFFNOVA^? 中空纖維膜是非對稱結(jié)構(gòu)，膜層致密，外層相對開放。其獨特的結(jié)構(gòu)設(shè)計可以使得非特異性吸附更低，過濾速率更快，通量更高，過濾時間更短，能有效的用于質(zhì)粒的濃縮與換液。

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圖3. 超濾膜包/中空纖維選擇標(biāo)準(zhǔn)

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圖4. 百林科TFFNOVA^? 系列中空纖維柱

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圖5. 百林科FiltraLinX^? Pilot超濾系統(tǒng)

第四步質(zhì)粒為質(zhì)粒的層析工藝，三步法可選擇百林科：Chromstar^? 6FF+MaXtar^? PlasmidCap HR+MaXtar^? Q HR。

案例分享

Chromstar^? 6FF為分子排阻層析填料，此步目的是去除RNA。在合適的鹽濃度下，pDNA最大，從外水先出，RNA后出，從而實現(xiàn)分離。此步關(guān)鍵工藝參數(shù)為平衡溶液、上樣載量、線性流速、柱高等。平衡一般使用2.1M (NH₄)₂SO₄，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5。高濃度硫酸銨RNA會收縮，RNA和DNA空間差異最大化，有利于DNA、RNA分離，并且直接銜接下一步嗜硫親和。上樣載量與分子大小差異有關(guān)，一般低于0.3CV，柱高一般大于30cm，流速一般低于60cm/h。該填料在某客戶質(zhì)粒純化中取得了良好的分離純化效果。

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圖6. 百林科Chromstar^? 6FF純化案例

MaXtar^? PlasmidCap HR為嗜硫親和層析填料，由于超螺旋質(zhì)粒與開環(huán)質(zhì)粒分子性質(zhì)高度類似，區(qū)別在于超螺旋質(zhì)粒具有更高的堿基暴露程度和表面電荷，與填料結(jié)合更強，嗜硫親和介質(zhì)可高效區(qū)分這一微弱差別從而實現(xiàn)分離。關(guān)鍵工藝參數(shù)為載量、平衡洗脫Buffer等。對于序列和大小不同的質(zhì)粒，需要對純化條件進行調(diào)整。開環(huán)的去除通常有兩種思路，第一種思路為在相對高濃度硫酸銨下，超螺旋與開環(huán)質(zhì)粒一同結(jié)合到層析介質(zhì)，通過一步合適條件的淋洗去除開環(huán)質(zhì)粒，最后洗脫超螺旋質(zhì)粒。第二種思路為將樣品調(diào)節(jié)至合適濃度硫酸銨，使開環(huán)流穿，超螺旋質(zhì)粒結(jié)合到層析介質(zhì)從而達(dá)到分離目的。對于不同的質(zhì)粒，純化條件需要優(yōu)化。常用的平衡溶液：2.1M (NH4)2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5。洗脫溶液：0.3M NaCl，1.7M (NH4)2SO4 ，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5。該填料在某客戶質(zhì)粒純化中取得了良好的分離純化效果，且載量可達(dá)2mg/mL。

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圖7. 百林科MaXtar^? PlasmidCap HR純化案例

MaXtar^? Q HR為陰離子交換填料，此步目的是去除內(nèi)毒素等痕量雜質(zhì)。關(guān)鍵工藝參數(shù)為載量、平衡及洗脫溶液等。常用的平衡溶液：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5。洗脫溶液：1 M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5。在某客戶案例中經(jīng)過MaXtar^? Q HR 進一步純化，載量可達(dá)2mg/mL，可有效將內(nèi)毒素控制在合格范圍內(nèi)。

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圖8. 百林科MaXtar^? Q HR純化案例

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圖9.質(zhì)粒三步法純化案例數(shù)據(jù)匯總

最后一步為UF/DF濃縮換液，除菌過濾。根據(jù)需求濃縮換液到適宜的濃度和溶液中。

常用的存儲溶液有TE（Tris-EDTA）溶液、Tris-HCl溶液、PBS、WFI、無核酶水等。

TE適合長期保存質(zhì)粒，EDTA抑制核酸酶活性，但會影響限制性內(nèi)切酶等活性，若后續(xù)要做質(zhì)粒線性化、IVT反應(yīng)等可以將質(zhì)粒存儲在WFI中。超濾需注意載量和剪切力等工藝參數(shù)以避免超濾時間過長和剪切力過大從而影響質(zhì)粒質(zhì)量。

質(zhì)粒經(jīng)典三步法雖最為常用，但卻有工藝時間長、生產(chǎn)成本高等缺點。因此，越來越多客戶選用改進的兩步法制備超螺旋質(zhì)粒。百林科針對不同的質(zhì)粒產(chǎn)品和用戶需求，可提供不同的質(zhì)粒產(chǎn)品純化策略。兩步法層析使用氯化鈣沉淀RNA代替分子排阻層析去除RNA，從而節(jié)省時間及硫酸銨用量。氯化鈣的濃度是關(guān)鍵工藝參數(shù)，不同質(zhì)粒氯化鈣沉淀的濃度也可能不同。需要注意的是，過高濃度的氯化鈣可能會沉淀掉較多的超螺旋質(zhì)粒，導(dǎo)致質(zhì)粒收率較低；過低濃度的氯化鈣濃度會使RNA沉淀不完全，導(dǎo)致RNA殘留過多，增加層析步驟的負(fù)荷。因此，不同質(zhì)粒需優(yōu)化氯化鈣沉淀的濃度參數(shù)。氯化鈣沉淀中間品經(jīng)澄清和UF/DF后，可使用MaXtar^? PlasmidCap HR+MaXtar^? Q HR/ MaXtar^? Butyl HR去除HCP、內(nèi)毒素、開環(huán)質(zhì)粒等雜質(zhì)，也可使用百林科Coll系列復(fù)合模式填料。復(fù)合模式填料具有分子篩層析、離子交換層析及疏水層析三種層析模式質(zhì)的協(xié)同作用，從而去除 HCP、RNA、內(nèi)毒素等雜質(zhì)。

質(zhì)粒線性化階段使用限制性內(nèi)切酶將超螺旋的質(zhì)粒DNA線性化，線性化質(zhì)粒須除去酶切引入的酶等雜質(zhì)，可選擇離子交換例如MaXtar^? Q HR或MaXtar^? DEAE等。最后需要超濾完成緩沖液的置換以達(dá)到IVT反應(yīng)的要求。

IVT反應(yīng)后mRNA純化工藝一般采用Oligo dT親和層析進行捕獲，可選擇百林科Maxgo^? oligo dT(25) pro，去除酶類、NTP及模板DNA等工藝相關(guān)雜質(zhì)，后采用高分辨的疏水或離子填料進行精細(xì)純化，去除片段或dsRNA等產(chǎn)品相關(guān)雜。也可以選用復(fù)合模式層析填料（Coll系列）代替Oligo dT。有應(yīng)用表明復(fù)合模式層析純化mRNA的載量高于Oligo dT親和層析的平均載量，并且可以有效去除消化后的pDNA、蛋白及NTP，且具有更快的工藝時間、需要更小的層析柱規(guī)格及更低成本的優(yōu)點。

百林科蘇州應(yīng)用中心簡介

百林科蘇州應(yīng)用中心占地面積3000sqm，設(shè)有研發(fā)辦公區(qū)、細(xì)胞培養(yǎng)實驗室、微生物實驗室、純化實驗室、中試車間、分析實驗室。蘇州應(yīng)用中心致力于為客戶提供上下游工藝開發(fā)，小試及中試規(guī)模樣品制備，驗證及培訓(xùn)等服務(wù)。

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