電荷異構(gòu)體、聚體與片段是抗體藥物的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)，其產(chǎn)生會影響抗體藥物的功效。

電荷異構(gòu)體是抗體分子的分子量，疏水性及電荷差異造成的異質(zhì)性，一般分為酸性異構(gòu)體和堿性異構(gòu)體。其產(chǎn)生主要原因是與翻譯后的修飾有關(guān)。電荷異構(gòu)體宏觀表現(xiàn)為在等電聚焦電泳圖上出現(xiàn)彌散或者多個(gè)條帶，離子交換色譜圖主峰前后出現(xiàn)小峰。

• 酸性電荷異構(gòu)體：主要由二硫鍵錯(cuò)配，三硫鍵形成，賴氨酸糖基化，天冬酰胺的去?；?/p>

• 堿性電荷異構(gòu)體：天冬氨酸異構(gòu)化，脯氨酸?；珻端賴氨酸，N端焦谷氨酸的形成。

電荷異構(gòu)可能會影響抗體的穩(wěn)定性、藥效、免疫原性、藥代動(dòng)力學(xué)，特征性的識別和分離電荷異構(gòu)體是至關(guān)重要的。

聚體是由抗體分子間通過共價(jià)鍵或氫鍵等分子間作用力形成的聚合物，是由兩個(gè)或多個(gè)蛋白組成的復(fù)合物，其形成過程十分復(fù)雜。包括： 蛋白結(jié)構(gòu)破壞，形成不可逆的聚合物；兩個(gè)抗體結(jié)合形成二聚體，并可能在此基礎(chǔ)上繼續(xù)增加單體，形成多聚；單抗未正確折疊，錯(cuò)誤折疊，正確折疊都可形成聚體；二硫鍵也可能形成聚體。

碎片是由于蛋白的氨基酸序列的局部結(jié)構(gòu)，溶劑條件以及金屬或自由基的存在而發(fā)生肽鍵降解，從而使抗體產(chǎn)生碎片。

電荷異構(gòu)體、聚體與碎片的去除策略需要結(jié)合離子交換層析及洗脫模式，及上游工藝控制等多維度來進(jìn)行篩選。本文不考慮上游工藝的優(yōu)化，著重圍繞層析方法及洗脫模式的去除方法，以降低或減少電荷異構(gòu)體、聚體與碎片。

依據(jù)不同電荷異構(gòu)體的pI差異，通過條件洗脫液的pH或鹽濃度梯度分離電荷異構(gòu)體及聚集體。例如,酸性異構(gòu)體在低pH下結(jié)合較弱，可以優(yōu)先洗脫；堿性異構(gòu)體則需要提高pH或鹽濃度以增強(qiáng)結(jié)合選擇性；陽離子層析（MaXtar^? S HC），在鹽和pH雙梯度分離酸堿異構(gòu)體可以達(dá)到較理想的純化效果，如圖1（下滑查看）。

MMC具有弱陽離子與疏水層析兩種層析機(jī)理，具有離子交換、疏水作用及氫鍵等作用，復(fù)合層析（MaXtar^? MMC HR）在離子交換層析模式下，可同時(shí)去除電荷異構(gòu)體和聚集體，如圖2（下滑查看）。

疏水層析根抗體的疏水性差異進(jìn)行分離。在高鹽濃度下，疏水殘基暴露，與疏水填料表面結(jié)合，隨鹽濃度的降低，使得不同疏水強(qiáng)度抗體進(jìn)行分離。在緩沖液添加PEG或精氨酸可改善聚體的效果。

層析條件：

• Buffer A：20mM HAc, 20mM PB, 20mM Tris,pH5.5；

• Buffer B：20mM HAc, 20mM PB, 20mM Tris, 1M NaCl,pH8.0。

層析填料：

• MaXtar^? S HC Column：100×7.7mm I.D.,4.7ml/CV；

• Sample：1.74ms/cm，pH5.5。

實(shí)驗(yàn)圖譜：

在抗體藥物下游純化過程中，選擇合適的層析步驟以去除電荷結(jié)構(gòu)體、聚體與片段，對于工藝開發(fā)和控制，尤其重要。比如：陽離子離子交換層析（MaXtar^? S HC），復(fù)合層析（MaXtar^? MMC、MaXtar^? MMC HR）的陽離子層析模式下對于電荷異構(gòu)體效果明顯；疏水層析，陽離子交換層析對于二聚體及更高的聚集體純化效果更明顯，而陰離子層析（MaXtar^? Q HR、MaXtar^? Q）對于抗體片段的去除效果更理想。