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微載體細(xì)胞培養(yǎng)案例分享

什么是Puredex^? Cyto-1微載體

Puredex^? Cyto-1 是一類基于交聯(lián)葡聚糖基架，帶有正電荷基團(tuán)的微載體，它可以為細(xì)胞提供廣闊的附著面，從而提高細(xì)胞密度，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)。微載體不僅為貼壁細(xì)胞改變培養(yǎng)方式提供了可能，更方便優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)工藝，實(shí)現(xiàn)降本增效。
Puredex^? Cyto-1 微載體可以用于多種宿主細(xì)胞的培養(yǎng)，包括 293 細(xì)胞、Vero 細(xì)胞、CHO 細(xì)胞等。獨(dú)特的產(chǎn)品性能，使得 Puredex^? Cyto-1 微載體成為當(dāng)今要求極高的上游細(xì)胞培養(yǎng)工藝中不可或缺的材料，可以在抗體、疫苗、核酸、酶和重組蛋白等生物制藥領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。
Puredex^? Cyto-1，采用生物兼容性好的交聯(lián)葡聚糖基架，表現(xiàn)出極佳的細(xì)胞培養(yǎng)性能。

微載體可以培養(yǎng)哪些細(xì)胞

哺乳動(dòng)物、禽類、魚和昆蟲細(xì)胞已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)微載體培養(yǎng), 它們具有廣泛的組織來源，包括原代細(xì)胞，二倍體細(xì)胞株和傳代/轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。此外，雜交細(xì)胞系和腫瘤來源的細(xì)胞系也同樣適用于微載體培養(yǎng)模式，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前可通過微載體培養(yǎng)的細(xì)胞種類已達(dá) 150 余種。

表1更新2.jpg

表1：微載體適用范圍

如何選擇微載體

表2更新.jpg

表2：微載體選擇參數(shù)

微載體的操作步驟

1、微載體預(yù)處理

首先，干燥的微載體在無 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸緩沖液（PBS pH=7.4，每克微載體加50-100mL）中在室溫下浸泡膨脹至少3h。棄去上清液，用新配制的無 Ca2+ 、Mg2+ 的PBS（pH=7.4，每克微載體加30-50mL）洗滌微載體數(shù)分鐘。接著，棄去 PBS，換上新的無 Ca2+ 、Mg2+ 的 PBS（pH=7.4，每克微載體加 30-50mL）。之后，微載體溶液用高壓滅菌法滅菌（121 ℃，30min）。微載體Puredex? Cyto-1 非常穩(wěn)定，可以反復(fù)進(jìn)行高壓滅菌而不影響其性能。滅菌結(jié)束后使用前，加入培養(yǎng)基潤(rùn)洗置換（20-50mL/g），之后加入 10%血清或無血清培養(yǎng)基放置平衡過夜。

微載體水化鏡檢圖

水化操作（關(guān)鍵點(diǎn)）

均勻懸?。涸谳p輕搖晃下，微載體能形成均勻的懸濁液，無肉眼可見的結(jié)團(tuán)。
良好沉降：靜置后，能在合理時(shí)間內(nèi)（10-20min）形成致密、平整的沉淀層，上清清澈。
顯微鏡觀察：在光學(xué)顯微鏡下，顆粒圓整、大小均一、表面光滑、無過多碎片。

2、微載體培養(yǎng)

準(zhǔn)備好消化好的細(xì)胞，連同之前準(zhǔn)備好的微載體一起加入方瓶或反應(yīng)器中（微載體加量 1-5g/L），在一定條件下開始培養(yǎng)，2-4小時(shí)后觀察細(xì)胞貼附情況。如果細(xì)胞貼附良好，繼續(xù)跟蹤培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

3、微載體培養(yǎng)操作要點(diǎn)

培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的 pH 與溫度水平，接種細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而非穩(wěn)定期）至終體積 1/3 的培養(yǎng)液中，以增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會(huì)。常使用 2-3g/L 的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。由于動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，間歇式培養(yǎng)；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入連續(xù)培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度 60-70r/min。
貼壁階段（4-8h）后：緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全混合。
培養(yǎng)維持期：進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（血球計(jì)數(shù)板/細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）、葡萄糖測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢。隨著細(xì)胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。

4、細(xì)胞計(jì)數(shù)方法（關(guān)鍵點(diǎn)）

離心收集

取1-2mL培養(yǎng)液放置離心管，離心（1000rpm，5min），棄上清，加入5 mL PBS 進(jìn)行潤(rùn)洗，潤(rùn)洗后離心（1000rpm，5min），棄上清。

消化

加入 1mL含0.25%胰酶消化液（建議比例 1：1），放置細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2） 2-20min，2min 一次，吸出 10ul-20ul 培養(yǎng)液放置載玻片（鏡檢查看細(xì)胞消化狀態(tài)），反復(fù)多次吹打，多次查看消化狀態(tài)，直至微載體和細(xì)胞完全分離（預(yù)計(jì) 10-15min 完全消化），加入等體積的培養(yǎng)基終止消化。

染色比例：0.2-0.4%

通用比例：1：1 50ul（培養(yǎng)液）+50ul（染色液），終濃度：0.2% 。
染色比例：1：4（適用于敏感細(xì)胞） 20ul（培養(yǎng)液）+80ul（染色液），終濃度：0.32% 。
染色時(shí)間：1-2min（微載體培養(yǎng)細(xì)胞更為脆弱，避免假陽性死細(xì)胞）。

取樣計(jì)數(shù)

取 10-20ul 培養(yǎng)液（染色后）加至計(jì)數(shù)板內(nèi)，使用顯微鏡（20x）進(jìn)行鏡檢。每個(gè)細(xì)胞只計(jì)數(shù)一次。調(diào)整焦距以防漏記。重點(diǎn)計(jì)數(shù)區(qū)域：四角 4 個(gè)方格邊線：細(xì)胞壓在左側(cè)或上側(cè)（計(jì)入）、細(xì)胞壓在右側(cè)或下側(cè)（不計(jì)入）。

工藝放大推薦

百林科CytoLinX^? RW

一次性搖擺式系統(tǒng)

CytoLinX^? RW 一次性搖擺式系統(tǒng)不僅可作為種子罐使用，還可以通過球轉(zhuǎn)球工藝輕松放大至一次性生物反應(yīng)器，搖擺運(yùn)動(dòng)能有效防止密度較高的微載體在底部沉淀堆積，確保每個(gè)微載體都能充分接觸營(yíng)養(yǎng)和氧氣，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的均勻貼附和生長(zhǎng)，其次該搖擺系統(tǒng)是一種操作簡(jiǎn)便，細(xì)胞友好度較高，是注重成本控制用戶的絕佳選擇。

圖8：百林科CytoLinX? RW 一次性搖擺式系統(tǒng)

百林科CytoLinX^? BR

一次性罐體式生物反應(yīng)器

為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)微載體規(guī)?；囵B(yǎng)，可以采用CytoLinX? BR 一次性罐體式生物反應(yīng)器進(jìn)行工藝放大，收獲時(shí)，可以直接在一次性袋內(nèi)進(jìn)行沉降或使用內(nèi)置的過濾裝置。許多一次性反應(yīng)袋設(shè)計(jì)有底部沉降袋或?qū)ｉT收獲口，可以方便地將含有細(xì)胞的微載體懸液轉(zhuǎn)移至收獲系統(tǒng)，減少了多次轉(zhuǎn)移帶來的污染風(fēng)險(xiǎn)和細(xì)胞損失。微載體容易在傳統(tǒng)不銹鋼反應(yīng)器的縫隙、攪拌軸密封處、閥門等死角殘留，極難清潔，是交叉污染的重大隱患。一次性袋子內(nèi)壁光滑、無死角，使用后即廢棄，從根本上解決了微載體殘留問題。設(shè)備提供精準(zhǔn)的溫度、pH和溶氧濃度控制，適用于大體積的生產(chǎn)需求，省去（CIP/SIP）復(fù)雜的清潔驗(yàn)證，同時(shí)具備優(yōu)異的密閉性和生物安全性，適用于多種工藝要求（同一個(gè)硬件適應(yīng)不同生產(chǎn)需求）。

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圖9：百林科CytoLinX^? BR 一次性罐體式生物反應(yīng)器

百林科蘇州應(yīng)用中心簡(jiǎn)介

占地面積3000sqm，設(shè)有研發(fā)辦公區(qū)、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室、微生物實(shí)驗(yàn)室、純化實(shí)驗(yàn)室、中試車間、分析實(shí)驗(yàn)室。蘇州應(yīng)用中心致力于為客戶提供上下游工藝開發(fā)，小試及中試規(guī)模樣品制備，驗(yàn)證及培訓(xùn)等服務(wù)。

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