上游通過大腸桿菌表達(dá)菌體，通過菌體收獲，下游的裂解工藝，澄清過濾、濃縮工藝，層析純化工藝可以獲得高純度的超螺旋DNA(scDNA)。下面從裂解以及澄清和層析等方面做重點(diǎn)的解析：

01、裂解工藝策略：大腸桿菌的裂解通常會(huì)采用堿裂解的方法進(jìn)行，操作方法簡單，經(jīng)濟(jì)。在大腸桿菌的菌體裂解時(shí)釋放大量的RNA、線性DNA，開環(huán)質(zhì)粒（ocDNA）及宿主蛋白（HCP）、宿主核酸（HCD）、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)給后續(xù)的超螺旋質(zhì)粒的純化帶來極大的挑戰(zhàn)。堿裂解工藝可通過優(yōu)化菌體的懸浮比例，裂解比例，裂解時(shí)長，中和比例和時(shí)間等參數(shù)，減少雜質(zhì)的產(chǎn)生，提高裂解效率。百林科可以提供相應(yīng)的Mixer 作為裂解設(shè)備來滿足GMP生產(chǎn)階段的需求。

02、澄清過濾：根據(jù)工藝需要一般選用10~50μm的除絮狀沉淀和0.45μm孔徑的濾器進(jìn)行二級澄清過濾或0.2μm的中空纖維膜進(jìn)行澄清過濾，收集的澄清液進(jìn)行TFF濃縮換液。澄清過濾可通過優(yōu)化濾器材質(zhì)，濾器的膜過濾載量，膜通量；0.2μm的中空纖維膜可選擇百林科的TFFNOVA?系列的中空纖維柱，目前在大腸的裂解澄清液中能達(dá)到平均30LMH的處理通量。

03、濃縮工藝策略：超濾濃縮可以去除RNA，HCP等其他雜質(zhì)，所需上樣體積。濃縮換液以優(yōu)化膜包或者中空纖維的材質(zhì)、孔徑，濃縮倍數(shù)，TMP控制，剪切力控制，提高工藝的重復(fù)性和可放大性。

04、層析純化工藝開發(fā)策略：目前質(zhì)粒層析工藝Chromstar 6FF+MaXtar PlasmidCap HR+MaXtar Q HR三步法最為經(jīng)典常用，針對不同的質(zhì)粒產(chǎn)品和用戶需求，百林科也有不同的質(zhì)粒產(chǎn)品純化策略，例如可以使用BaronCHT Type II去除HCD和ocDNA，或者使用CaCl2或硫酸銨沉淀樣品后使用MaXtar Q+MaXtar PlasmidCap HR/ BaronCHT Type II兩步層析純化超螺旋質(zhì)粒。

下面我們以經(jīng)典的三步法

做純化工藝的分享

圖5：Chromstar 6FF在質(zhì)粒純化的效果

根據(jù)利用PlasmidCap配基的嗜硫吸附及親水-疏水混合模式作用，可去除結(jié)合能力較弱的線性DNA，ocDNA，主要通過上樣載量，保留時(shí)間，上樣與洗脫的pH及電導(dǎo)的優(yōu)化，提高超螺旋DNA比例。

推薦使用：百林科 MaXtar PlasmidCap HR

推薦buffer 體系：

EQ Buffer：1.9 mol/L (NH4)2SO4+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7

Elution Buffer:1.7 mol/L (NH4)2SO4+0.3 M NaCl+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7

圖6：MaXtar PlasmidCap HR在質(zhì)粒上的應(yīng)用（去除OcDNA）

依據(jù)不同電荷的分子保留強(qiáng)弱的不同，達(dá)到去除內(nèi)毒的目的。主要通過上樣載量，保留時(shí)間，洗脫電導(dǎo)和pH的優(yōu)化，高純度，低工藝雜質(zhì)的超螺旋質(zhì)粒。

推薦使用：百林科 MaXtar Q HR

推薦Buffer 體系：

EQ Buffer: 0.4 M NaCl+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7

Elution Buffer: 0.8 M NaCl+50 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L EDTA，pH=7.3~7.7

圖7：MaXtar Q HR在質(zhì)粒上的應(yīng)用

客戶使用百林科三步層析法純化質(zhì)粒的結(jié)果匯總：

如果遇到一些質(zhì)粒的聚集體等的去除可以嘗試CHT的純化方案。CHT是一種無機(jī)純相層析介質(zhì)，高溫焙燒成球體，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)陽離子交換和鈣金屬親和混合分離模式，在去除聚集體和HCD方面具體獨(dú)特的優(yōu)勢。

CHT在超螺質(zhì)粒純化去除HCD及scDNA，優(yōu)化上樣及洗脫條件可獲得更高純度的超螺旋質(zhì)粒。

圖8：BaronCHT Type II在質(zhì)粒純化上的應(yīng)用（7.7 mm×100 mm，4.7mL/CV)

菌體裂解液繼續(xù)超濾濃縮后的樣品，經(jīng)過CaCl2或硫酸銨沉淀后質(zhì)粒樣品可以，經(jīng)過離子交換層析和親和層析結(jié)合純化超螺質(zhì)粒，推薦MaXtar Q HR + MaXtar PlasmidCap HR ，通過優(yōu)化上樣，洗脫等工藝條件，可獲得理想的超螺旋質(zhì)粒?；蛘進(jìn)aXtar COLL 700+ MaXtar PlasmidCap HR的方案，其中COLL700是一款復(fù)合層析介質(zhì)。區(qū)別于傳統(tǒng)的層析介質(zhì)，它由兩層不同的結(jié)構(gòu)組成：外殼是多孔的鈍化層 ，確保 700KD 以上的大分子不會(huì)進(jìn)孔，直接走外水流穿；核心是偶聯(lián)了同時(shí)具有疏水和吸附負(fù)電荷作用基團(tuán)的球形內(nèi)核，最大程度結(jié)合宿主蛋白、 核酸等雜質(zhì)。菌體裂解液繼續(xù)超濾濃縮后的樣品，經(jīng)過COLL 700復(fù)合層析和親和層析結(jié)合純化超螺質(zhì)粒，推薦MaXtar COLL 700+MaXtar PlasmidCap HR，通過優(yōu)化上樣，洗脫等工藝條件，可獲得理想的超螺旋質(zhì)粒。

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