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解鎖病毒載體下游純化工藝路線

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病毒載體是一種，常使用于分子生物學(xué)的工具，可將遺傳物質(zhì)帶入細(xì)胞?？砂l(fā)生于完整活體或是細(xì)胞培養(yǎng)中。其原理是利用病毒具有傳送其基因組進(jìn)入其他細(xì)胞，進(jìn)行感染的分子機(jī)制。常應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、基因療法或疫苗相關(guān)產(chǎn)品中。

目前在人用藥物領(lǐng)域已經(jīng)有多種病毒被開發(fā)成為臨床可用的遞送系統(tǒng)。目前，比較常用于臨床或臨床試驗(yàn)的病毒載體主要包括：腺病毒（AdV）、腺相關(guān)病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(RV)、慢病毒(LV)、單純皰疹（HSV）等，純化工藝流程如下圖：

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病毒顆粒純化是一項(xiàng)有挑戰(zhàn)性的工作，下游純化不僅需要將相關(guān)雜質(zhì)例如HCD，HCP，質(zhì)粒DNA等去除，還要面對(duì)病毒顆粒聚集，包膜破壞，空實(shí)心，穩(wěn)定性等等一系列挑戰(zhàn)。

腺相關(guān)病毒（AAV）載體

腺相關(guān)病毒是一種非致病性病毒，安全性好、宿主范圍廣、物理性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)外源基因，在基因治療中得到廣泛應(yīng)用的載體[1]。

病毒收獲時(shí)，通過物理或化學(xué)方法裂解細(xì)胞，常見多用吐溫或曲拉通，AAV從裂解的宿主細(xì)胞中釋放出來，深層濾器澄清過濾后，使用全能核酸酶對(duì)殘留的核酸片段剪切，此步驟需保證良好的溫度與作用時(shí)間，法規(guī)要求，核酸片段應(yīng)切至200bp以下。再經(jīng)TFF換液濃縮，此工藝環(huán)節(jié)，要避免濃縮倍數(shù)過高，引起病毒顆粒聚集，常規(guī)濃縮倍數(shù)要小于10倍；同時(shí)還要保證較低的剪切力，以免對(duì)病毒活性損傷，百林科的TFFNOVA^? 中空纖維膜是非對(duì)稱結(jié)構(gòu)，膜層致密，外層相對(duì)開放。其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可以使得生物負(fù)載更低，非特異性吸附更低，過濾速率更快，通量更高，過濾時(shí)間更短，能有效的用于病毒顆粒的換液與濃縮。

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百林科TFFNOVA^? 中空纖維過濾器

之后是兩步層析，AAV捕獲階段建議使用MaXtar^? AAV/MaXgo^? AAV對(duì)病毒進(jìn)行捕獲。此步驟可加入適量添加劑例如精氨酸，甘油等，以防止病毒顆粒聚集或吸附于流路管壁。精純采用MaXtar^? Q 進(jìn)一步進(jìn)行除雜，去除HCP，HCD，并進(jìn)行空殼與實(shí)心的分離，空殼實(shí)心的分離常因不同的添加劑表現(xiàn)出不同分離效果，建議使用MgSO₄或Na₂SO₄等改善空殼與實(shí)心的分離效果；另外此步工藝需保證較低的上樣電導(dǎo)，以期病毒顆粒完全掛柱，避免流穿。MaXtar^? Q是一款強(qiáng)陰離子交換層析介質(zhì)，相比于傳統(tǒng)的強(qiáng)陰離子交換層析介質(zhì)，MaXtar^? Q表現(xiàn)出更優(yōu)的性能：改良的MaXtar^? 基架具有更強(qiáng)剛性，因此在較低的反壓下能夠?qū)崿F(xiàn)更高工藝流速，提高工藝效率；通過升級(jí)配基偶聯(lián)方式，提高層析介質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量。最后再進(jìn)行TFF與除菌過濾，完成原液制備。

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腺病毒（AdV）載體

腺病毒載體是經(jīng)基因重組改造復(fù)制缺陷的腺病毒載體系統(tǒng)。腺病毒載體的優(yōu)勢(shì)在于：感染效率高且可以感染分裂的和非分裂的細(xì)胞，包載量大，不會(huì)有整合到人體基因組的隨機(jī)整合潛在風(fēng)險(xiǎn)，轉(zhuǎn)錄表達(dá)時(shí)間較快，工業(yè)化生產(chǎn)易于放大，作為疫苗載體，腺病毒有較強(qiáng)免疫原性^[2]。其下游純化工藝與AAV主要工藝區(qū)別在于兩步層析工藝，由于腺病毒粒徑較大，通常為70-90nm的顆粒，層析部分，第一步可采用陰離子層析即使用MaXtar^? Q進(jìn)行捕獲，這一步可完成病毒顆粒的捕獲與部分除雜。第二步可直接使用多模式層析MaXtar^? COLL 400/700進(jìn)行精純，可有效去除HCD，HCP等雜質(zhì)。MaXtar? COLL 400/700是一款多模式層析介質(zhì)。相比于傳統(tǒng)的單一模式層析介質(zhì)，MaXtar^? COLL表現(xiàn)出更優(yōu)的性能：獨(dú)特的雙層結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，以流穿模式處理400KD/700KD以上的大分子，工藝優(yōu)化更容易，更方便線性放大。改良的MaXtar^? 基架具有更強(qiáng)剛性，因此在較低的反壓下能夠?qū)崿F(xiàn)更高工藝流速，提高工藝效率。相比于傳統(tǒng)的凝膠過濾層析，擁有更大的上樣量，降低成本。后續(xù)工藝再進(jìn)行TFF換液濃縮，除菌過濾，完成原液制備。

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慢病毒（LV）/單純皰疹病毒（HSV）載體

慢病毒載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。它能高效的將目的基因?qū)雱?dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系，對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力^[3]。單純皰疹病毒載體是溶瘤病毒的一種。溶瘤病毒是近年興起的一種新型腫瘤基因治療生物制劑。研究證實(shí)，溶瘤病毒能夠感染并使某些腫瘤細(xì)胞溶解破壞，而在正常組織細(xì)胞中既不復(fù)制也無破壞殺傷作用^[4]。類似像慢病毒，皰疹病毒，與其他病毒載體最大區(qū)別是它們是一類有包膜，且此包膜容易在純化過程中破壞，從而大大影響病毒顆?；钚?；并且病毒顆粒大，約為100-200nm，甚至大于300nm。

因此，對(duì)下游純化是巨大的挑戰(zhàn)。在層析部分中首選多模式層析MaXtar^? COLL 400/700，能夠無壓力的將大粒徑的病毒和較小的雜質(zhì)進(jìn)行分離去除。該填料在客戶某溶瘤病毒的純化中取得了良好的效果，滴度與雜質(zhì)殘留符合客戶要求（如下圖）。

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溶瘤病毒的純化案例

在TFF工藝階段中由于包膜對(duì)剪切力的敏感性，建議控制剪切力不超過3000 1/S，推薦使用百林科TFFNOVA^? 中空纖維膜并搭配FiltraLinX^? 桌面型半自動(dòng)中空纖維超濾系統(tǒng)。

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百林科FiltraLinX? 桌面型半自動(dòng)

中空纖維超濾系統(tǒng)

以上基本涵蓋了主流病毒載體純化的要點(diǎn)與難點(diǎn)，在面對(duì)不同的病毒顆粒純化時(shí)，可靈活選取不同填料，調(diào)整工藝順序，使終產(chǎn)品符合相關(guān)滴度，純度，雜質(zhì)去除等等質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的要求。

百林科蘇州應(yīng)用中心簡(jiǎn)介

占地面積3000sqm，設(shè)有研發(fā)辦公區(qū)、細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室、微生物實(shí)驗(yàn)室、純化實(shí)驗(yàn)室、中試車間、分析實(shí)驗(yàn)室。蘇州應(yīng)用中心致力于為客服提供上下游工藝開發(fā)，小試及中試規(guī)模樣品制備，驗(yàn)證及培訓(xùn)等服務(wù)。

參考文獻(xiàn)

【1】Wang J H , Gessler D J , Zhan W ,et al.Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases[J].Signal Transduction & Targeted Therapy, 2024, 9(1).DOI:10.1038/s41392-024-01780-w..

【2】張茗婧.腺病毒載體肺炎疫苗的構(gòu)建及免疫評(píng)價(jià)研究[D].天津科技大學(xué),2023.DOI:10.27359/d.cnki.gtqgu.2023.000296.

【3】房恩岳,張麗萍,馬雪征,等.慢病毒載體系統(tǒng)及其安全性研究進(jìn)展[J].病毒學(xué)報(bào),2023,39(04):1181-1192.DOI:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.004349.

【4】吳振,張紫怡,汪洋,等.重組Ⅱ型溶瘤單純皰疹病毒純化工藝的建立[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2018,31(05):552-554+562.DOI:10.13200/j.cnki.cjb.002184.

文章封面圖片來源于站酷海洛

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