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RSV 疫苗四類純化工藝方案解析


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呼吸道合胞病毒 (Respiratory Syncyial Virus,RSV) 是一種反式單鏈RNA病毒，共編碼11種蛋白，其中G和F表面蛋白在RSV吸附和融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是產(chǎn)生中和抗體最重要的抗原位點(diǎn)，也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫原性和抗病毒的最主要靶點(diǎn)。感染呼吸道合胞病毒會(huì)導(dǎo)致黏液分泌增加及發(fā)炎，導(dǎo)致氣道變窄，是引起嬰幼兒、老年人及免疫功能缺陷患者下呼吸道感染的重要病原體。

RSV的基因組全長(zhǎng)為15.2 Kb，編碼11個(gè)病毒蛋白，其中病毒包膜上有三種蛋白：粘附蛋白G、融合蛋白F和小疏水蛋白SH。G和F蛋白在病毒感染過(guò)程中起核心作用，因此在RSV疫苗開(kāi)發(fā)中，主要針對(duì)G蛋白和F蛋白開(kāi)展抗原設(shè)計(jì)。


目前RSV疫苗的研發(fā)主要集中在四大類，包括減毒活疫苗、病毒載體疫苗、重組亞單位疫苗和核酸疫苗。本文總結(jié)了四種類型的RSV疫苗的純化工藝方案。



減毒活疫苗

將收獲的病毒液經(jīng)過(guò)核酸酶處理和過(guò)濾澄清后，利用層析填料MaXtar? COLL 700填料進(jìn)行純化，以高效去除宿主蛋白和核酸。此工藝相比傳統(tǒng)分子篩層析具有高上樣量（可達(dá)10 CV）的優(yōu)點(diǎn)，MaXtar? COLL 700流穿液采用300 KDa的中空纖維膜柱進(jìn)行濃縮和換液。此工藝整體的回收率為50~60%。

圖片1更新.jpg


RSV病毒載體疫苗

用于RSV疫苗的病毒載體類型主要有腺病毒載體和痘病毒載體。其中，已批準(zhǔn)上市的腺病毒載體新冠疫苗具有較為成熟的生產(chǎn)工藝。


以腺病毒載體為例，可采用以下工藝：

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RSV重組亞單位疫苗

適合疫苗開(kāi)發(fā)的F蛋白具有兩種構(gòu)象，即融合前F蛋白 (Pre-F) 和融合后F蛋白 (Post-F)，早期疫苗產(chǎn)品都是基于Post-F蛋白設(shè)計(jì)的，誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度低，不足以抵抗RSV感染。直到2013年，Pre-F構(gòu)象被解析后，以Pre-F為基礎(chǔ)的RSV疫苗研發(fā)進(jìn)入快速發(fā)展階段。


以制備F蛋白為例，可采用以下工藝過(guò)程：經(jīng)CHO細(xì)胞培養(yǎng)，收獲上清并澄清，可經(jīng)過(guò)病毒滅活和初步層析捕獲后，利用離子交換填料MaXtar? Q和復(fù)合模式層析MaXtar? MMA進(jìn)行精細(xì)純化，有效去除宿主蛋白和核酸，同時(shí)確保RSV Pre-F蛋白的純度。隨后進(jìn)行納濾、超濾和除菌過(guò)濾獲得抗原原液。


方案一更新1.png


第二個(gè)方案，則采用百林科三步填料純化法MaXtar? MMC初步層析捕+MaXtar? Q+MaXtar? Butyl HR，純度可達(dá)到99.5%.

方案2更新1.png



第一步MaXtar? MMC層析

  1. Sample source：BW243250108BRU01E(pH7.16,Cond:2.38ms/cm)

  2. Resin：MaXtar? MMC；Column：100×7.7mm，Volume：4.7mL

  3. Sample:BW243250110BRO01L

  4. Capacity：5.78g/L，RT：4.7min


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第二步MaXtar? Q 層析

  1. Sample source：BW243250116BRO01E01(pH7.04,Cond:13.67ms/cm)

  2. Resin：MaXtar? Q；Column：100×7.7mm，Volume：4.7mL

  3. Sample:BW243250117BRN01L(pH7.51,Cond:3.94ms/cm)

  4. Capacity：g/L，RT：4.7min


圖片8.png

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第三步層析 MaXtar? Butyl HR

  1. Sample source：BW243250117BRN01E01(pH7.39,Cond:17.07ms/cm)

  2. Resin：MaXtar? Butyl HR；Column：100×7.7mm，Volume：4.7mL

  3. Sample:BW243250117BRH01L(pH7.10,Cond:169.83ms/cm,16mL)

  4. Capacity：g/L，RT：4.7min

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RSV mRNA疫苗

mRNA類疫苗工藝包括了質(zhì)粒模板的制備、mRNA的合成與純化、LNP的制備及無(wú)菌灌裝等步驟。質(zhì)粒的制備工藝可以選擇百林科的經(jīng)典三步法工藝和改進(jìn)兩步法工藝:

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mRNA純化工藝一般采用 Oligo DT etc親和層析進(jìn)行捕獲，去除工藝相關(guān)雜質(zhì)（酶類、NTP及模板DNA等）。捕獲階段除了用親和層析，還可以選用復(fù)合模式層析填料MaXtar? COLL 700，該工藝具有高的回收率及更低的雜質(zhì)含量?jī)?yōu)點(diǎn)。


精細(xì)純化可以選擇高分辨率強(qiáng)陰離子交換填料如MaXtar? Q HR，也可以選擇高分辨率疏水填料MaXtar? phenyl HR 或MaXtar? Butyl HR，去除片段或dsRNA等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。

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綜上,目前我們?cè)赗SV項(xiàng)目的純化上積累了豐富的工藝開(kāi)發(fā)經(jīng)驗(yàn)。百林科作為生物工藝關(guān)鍵設(shè)備與耗材的供應(yīng)商，在提供層析介質(zhì)的同時(shí)，也提供相應(yīng)的層析設(shè)備及層析柱，超濾系統(tǒng)以及其他相關(guān)產(chǎn)品和應(yīng)用服務(wù)，歡迎大家垂詢。 


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