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輪狀病毒疫苗：從臨床應(yīng)用到純化技術(shù)的深度剖析

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輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬于呼腸病毒科輪狀病毒屬，為雙鏈 RNA 病毒。因電鏡下外形呈車輪狀得名，是引起５歲以下兒童急性脫水性胃腸炎的主要病原體。與EV71、柯薩奇病毒等引起腹瀉的病毒一樣，輪狀病毒目前無特效藥物治療。所以，接種輪狀病毒疫苗是公認(rèn)的預(yù)防輪狀病毒感染的最有效、最安全的措施，是降低輪狀病毒感染風(fēng)險(xiǎn)和大幅減輕疾病負(fù)擔(dān)的有效策略。

輪狀病毒基因組由11個(gè)雙鏈RNA片段組成，編碼結(jié)構(gòu)蛋白為VP1~4、VP6和VP7，VP4決定P分型，VP7決定G分型，其中VP6可將RV分為A-J10個(gè)組。A、B、C、H組均可感染人類，其中A組RV引起的癥狀最為嚴(yán)重。

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圖片來源于網(wǎng)絡(luò)

目前，全球上市的7種RV疫苗均為口服減毒活疫苗。其中RotaTeq（RV5，默沙東）與RotaSIIL為五價(jià)減毒活疫苗。Rotarix（RV1，GSK）、Rotavac（印度巴拉特公司）、Rotavin-M1（越南POLYVAC）與LLR（Lanzhou lamb rotavirus，LLR）為單價(jià)減毒活疫苗，RotaTeq、Rotarix、Rotavac和Rotasiil 已通過 WHO預(yù)認(rèn)證，Rotavin-M1和羊輪狀病毒疫苗（LLR）分別僅在越南和中國使用。

2023年4月17日，國藥集團(tuán)中國生物蘭州生物制品研究所自主研發(fā)的口服三價(jià)重配輪狀病毒減毒活疫苗（Vero細(xì)胞）獲得國家藥品監(jiān)督管理局上市許可批準(zhǔn)，成為國內(nèi)首個(gè)獲準(zhǔn)上市的三價(jià)輪狀病毒疫苗。該疫苗交叉保護(hù)性好，可有效預(yù)防G1、G2、G3、G4和G9型輪狀病毒導(dǎo)致的嬰幼兒腹瀉。

目前，在研的RV疫苗種類有減活疫苗、重配疫苗、重組VLP疫苗、減毒重組和亞單位疫苗等。

減毒輪狀病毒純化工藝

輪狀病毒大多在Vero細(xì)胞上進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)傳代，若需在反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，可采用百林科Puredex^? Cyto-1微載體培養(yǎng)。

病毒收獲后的層析選擇：可利用MaXtar^? COLL700/400收獲大量病毒，之后利用Q Chromstar^? FF達(dá)到去除雜蛋白的效果。百林科MaXtar^? 高剛性基架有優(yōu)秀的壓力流速表現(xiàn)，利于后期生產(chǎn)放大。

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圖1：MaXtar^? 基架壓力流速曲線

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圖2：MaXtar^? COLL 700純化病毒圖譜

MaXtar^? COLL 700 是一款多模式層析介質(zhì)。區(qū)別于傳統(tǒng)的層析介質(zhì)，它由兩層不同的結(jié)構(gòu)組成：外殼是多孔的鈍化層，確保700KD 以上的大分子不會(huì)進(jìn)孔，直接走外水流穿；核心是偶聯(lián)了同時(shí)具有疏水和正電荷吸附作用基團(tuán)的球形內(nèi)核，可最大程度結(jié)合宿主蛋白、核酸等雜質(zhì)。該層析介質(zhì)能很好的用于多種大分子生物樣本的分離純化，比如：病毒及類病毒顆粒等。

相比于傳統(tǒng)的單一模式層析介質(zhì)，MaXtar^? COLL 700/400 表現(xiàn)出更優(yōu)的性能：

獨(dú)特的雙層結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，以流穿模式處理700/400KD 以上的大分子，工藝優(yōu)化更容易，更方便線性放大。
改良的MaXtar^? 基架具有更強(qiáng)剛性，因此在較低的反壓下能夠?qū)崿F(xiàn)更高工藝流速，提高工藝效率。
相比于傳統(tǒng)的凝膠過濾層析，擁有更大的上樣量，有助于降低成本。

選擇技巧：

MaXtar^? COLL 400：如有病毒/大分子在MaXtar^? COLL 700上收率不佳，有明顯吸附現(xiàn)象，可嘗試選擇更小孔徑的MaXtar^? COLL 400進(jìn)行優(yōu)化。
MaXtar^? COLL 700：主要適用分子量大于700KD（約30nm）的病毒/大分子。

重組輪狀病毒抗原純化工藝

1、亞單位抗原兩步純化

現(xiàn)有表達(dá)重組亞單位輪狀病毒抗原的純化工藝：

第一步層析采用Q Chromstar^? FF層析結(jié)合洗脫模式，以收獲洗脫峰。

第二步層析可采用疏水層析，BaronHAP^?，MaXtar^? MMA。

Q Chromstar^? FF+MaXtar^? MMA兩步層析純化結(jié)果：

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圖3：Q Chromstar^? FF+MaXtar^? MMA兩步層析結(jié)果

采用BARONHAP? 流穿模式進(jìn)行第二步層析時(shí)，純度可以得到明顯提升，羥基磷灰石去除雜蛋白能力較強(qiáng)，電泳條帶單一，與傳統(tǒng)疏水層析相比，純度更高，無明顯雜帶，在P2-VP8抗原純化中純度可達(dá)99%，同等條件下疏水純度為90%。

羥基磷灰石BARONHAP?（Ca10(PO4)6(OH)2）是一種無機(jī)純相層析介質(zhì)，高溫焙燒成球體，其晶體結(jié)構(gòu)與骨羥基磷灰石相同，且球體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，粒徑均勻。羥基磷灰石與生物分子之間具有多種模式的相互作用，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)陽離子交換和鈣金屬親和兩種分離機(jī)制。陽離子交換主要依賴于羥基磷灰石上帶負(fù)電荷的磷酸基，同時(shí)，生物分子上的羧基簇合物、磷基簇合物等都能通過金屬親和作用與羥基磷灰石上的鈣形成更強(qiáng)的結(jié)合。由于這些獨(dú)特的分離機(jī)制，使得羥基磷灰石成為當(dāng)今要求極高的下游工藝中不可或缺的層析介質(zhì)，在抗體、疫苗（細(xì)菌多糖、肺炎多糖、病毒等）、核酸、酶和重組蛋白等生物制藥領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。

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圖4：BARONHAP^? 工作原理和微觀結(jié)構(gòu)

2、VLP 疫苗高效純化

RV病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）疫苗是具有自我組裝能力的多亞單位蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，與天然病毒相比，不含遺傳物質(zhì)，不具傳染性，但模擬了天然病毒的整體結(jié)構(gòu)，通常比單體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更具免疫原性。VLP的顆粒大小范圍為20~100 nm，這恰好是樹突狀細(xì)胞吸收納米顆粒和激活T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答的最佳范圍。

對(duì)RV病毒樣顆粒疫苗的層析純化,通常會(huì)采用復(fù)合模式如MaXtar^? COLL 700/400，也可結(jié)合其他SEC,IEC,HIC層析方式達(dá)到高效分離純化VLP的目的。

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圖5：MaXtar? COLL 400純化VLP圖譜

輪狀病毒純化工藝的優(yōu)化，不僅是提升疫苗安全性與效價(jià)的關(guān)鍵，更是推動(dòng)公共衛(wèi)生防線升級(jí)的重要一環(huán)?？茖W(xué)無止境，創(chuàng)新不停歇。歡迎使用百林科產(chǎn)品，助力疫苗研發(fā)與生產(chǎn)降本增效！共同期待，通過技術(shù)突破讓輪狀病毒防控邁入新紀(jì)元！

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本文封面來源于站酷海洛

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