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GLP-1及類(lèi)似物工藝特點(diǎn)

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GLP-1（胰高血糖素樣肽-1）是一種在調(diào)節(jié)血糖水平中 起重要作用的激素。近年來(lái)，GLP-1及其類(lèi)似物在糖尿病治療中受到了廣泛關(guān)注。由于其可刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌,所以成為了美國(guó) DM 協(xié)會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì) DM 學(xué)分會(huì)推薦的強(qiáng)效降糖藥物[1-2]。

GLP-1類(lèi)似物包括艾塞那肽 (exenatide)、利西那肽 (lixisenatide)、利拉魯肽 (liraglutide)、杜拉魯肽 (dulaglutide)、索瑪魯肽(sermaglutide) 及阿比魯肽 (albiglutide) 等 [3]，已上市GLP-1類(lèi)藥物主要包括貝那魯肽、艾塞那肽、利拉魯肽、利西那肽、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)包載的長(zhǎng)效艾塞那肽、阿必魯肽、杜拉魯肽、索馬魯肽、聚乙二醇洛賽那肽注射液和口服索馬魯肽[4]。

然而，GLP-1及其類(lèi)似藥的生物活性易受其低純度的影響，且根據(jù)不同肽的開(kāi)發(fā)策略和生產(chǎn)特性（圖1）圖，需要采用不同的純化路線，目前在研的GLP-1類(lèi)似藥主流工藝如下：

1、改造GLP-1本身結(jié)構(gòu)

2、連接抗體Fc片段的GLP-1類(lèi)似藥

3、連接HSA片段的GLP-1類(lèi)似藥

4、未偶聯(lián)復(fù)雜配基或側(cè)鏈的GLP-1類(lèi)似藥

5、連接PEG、脂肪酸側(cè)鏈的GLP-1類(lèi)似藥

因此，開(kāi)發(fā)有效的純化方法對(duì)于提高其生物活性和臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

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圖1 GLP-1類(lèi)似物的開(kāi)發(fā)策略[5]

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圖2 利拉魯肽分子結(jié)構(gòu)示意圖

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圖3 司美格魯肽分子結(jié)構(gòu)示

純化工藝簡(jiǎn)介

GLP-1及其類(lèi)似物上游制備工藝主要分為兩大類(lèi)：生物發(fā)酵法（如：利拉魯肽、司美格魯肽）與化學(xué)合成法（如：替爾泊肽、艾本那肽）。

化學(xué)合成法：

艾本那肽制備為例，以氨基樹(shù)脂為原料，先將樹(shù)脂脫Fmoc保護(hù)，再用逐一縮合的方式依次連接帶有保護(hù)基的氨基酸，直至完成樹(shù)脂肽直鏈合成；然后脫除Lys( Mtt )的側(cè)鏈Mtt保護(hù)基，再用逐一縮合的方式依次連接側(cè)鏈連接劑，得到艾本那肽前體樹(shù)脂肽。再通過(guò)裂解、純化得到艾本那肽前體及其類(lèi)似物[6]。

優(yōu)勢(shì)：

可插入非天然AA（如含非天然氨基酸的索馬魯肽和聚乙二醇洛賽那肽一般采用固相合成法）；下游純化簡(jiǎn)單，可沉淀離心得到粗肽。粗肽經(jīng)過(guò)反相填料循環(huán)純化來(lái)獲取精肽[7]。

劣勢(shì)：

合成肽段一般不超過(guò)50個(gè)AA

生物發(fā)酵法：

大腸桿菌/酵母和CHO細(xì)胞比較常見(jiàn)，有多肽與白蛋白或者Fc等其他標(biāo)簽融合表達(dá)。針對(duì)融合蛋白表達(dá)的GLP-1RA多肽的純化和酶切工藝，要經(jīng)過(guò)膜過(guò)濾、鎳親和層析、反相純化等處理，獲得高純度肽-融合蛋白，之后對(duì)其進(jìn)行酶切、純化，即可獲得多肽主鏈，也有利用通過(guò)構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)染等步驟構(gòu)建工程菌，培養(yǎng)并誘導(dǎo)工程菌融合蛋白包涵體表達(dá)，之后通過(guò)變性溶解、復(fù)性、酶切、親和流穿和離子交換純化等步驟，最終獲得GLP?1及其類(lèi)似物[10-12]。

優(yōu)勢(shì)：

同時(shí)安全性高、成本低、生產(chǎn)規(guī)模大，適合長(zhǎng)肽段的發(fā)酵。

劣勢(shì)：

下游純化路線較長(zhǎng)。

就目前來(lái)看，生物發(fā)酵法的成本相對(duì)較低。不同的上游制備工藝也會(huì)對(duì)下游層析工藝提出不同的需求。

表1 不同生物發(fā)酵法的填料選擇

1、酵母/大腸表達(dá)GLP-1的純化工藝：

第一步和第二步陰陽(yáng)離子層析可以去除大量HCP和HCD，收獲相對(duì)比較純的粗肽，第三步反相層析則可進(jìn)一步去除降解肽和異構(gòu)肽。

2、大腸桿菌表達(dá)His標(biāo)簽GLP-1類(lèi)似物的純化工藝

大腸表達(dá)通常為包涵體，溶解包涵體會(huì)加入高濃度尿素或鹽酸胍和還原劑，推薦使用TED螯合的Ni Chromstar? Excel. 其他親和填料如Glutathione Chromstar? 4FF可以適用于GST標(biāo)簽蛋白的純化。

3、CHO表達(dá)融合蛋白GLP-1類(lèi)似物（GLP-1-Fc）純化工藝

CHO表達(dá)GLP-1類(lèi)似物為FC融合蛋白，可參考抗體類(lèi)蛋白進(jìn)行純化。若為HSA融合，則可以采用Blue Chromstar? FF替換上圖的第一步層析。

圖5 ＧＬＰ-１-Ｆｃ融合蛋白ProteinA親和純化圖譜[7]

圖6 GLP-1融合白蛋白藍(lán)膠親和純化譜圖[8]

參考文獻(xiàn)：

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[2] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì). 中國(guó)2型糖尿病防治指南(2020年版)[J]. 中華糖尿病雜志, 2021, 13(4): 315-409.

[3] Drucker DJ. GLP-1 physiology informs the pharmacotherapy of obesity. Mol Metab, 2022(57):101351.

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