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純化小技巧 | 高效去除聚集體，多模式層析顯神通


隨著生物藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高，聚集體控制已成為抗體、融合蛋白等治療藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中的重大挑戰(zhàn)。聚集體是關(guān)鍵的質(zhì)量屬性，并應(yīng)在生產(chǎn)工藝過(guò)程進(jìn)行有效控制。相比于傳統(tǒng)的單一層析模式，多模式層析填料的配基可以表現(xiàn)出多種不同模式的作用力，在一個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)對(duì)各種類(lèi)型雜質(zhì)的選擇性清除，從而提高回收率和產(chǎn)品質(zhì)量。


基于上述情況，百林科整理了不同多模式層析填料的聚集體去除應(yīng)用案例。



復(fù)合模式陰離子:

通過(guò)流穿模式去除聚集體


復(fù)合模式陰離子是一款強(qiáng)陰離子的復(fù)合模式填料，配基通過(guò)多種作用與目標(biāo)分子結(jié)合，如離子作用、疏水作用和氫鍵作用。復(fù)合模式陰離子經(jīng)常用于抗體純化中的精純階段，可以去除聚集體、蛋白A配基、HCP、DNA 和病毒等多種雜質(zhì)。復(fù)合模式陰離子配基自有專(zhuān)利。


  • 平衡Buffer: 50 mM NaAc-HAc，150 mM NaCl，pH 5.0

  • 上樣：?jiǎn)慰褂H和后洗脫液（pH調(diào)節(jié)到5.0）（載量40 mg/ml）

  • 淋洗Buffer: 50 mM NaAc-HAc，150 mM NaCl，pH 5.0

圖片1.png

圖1： 復(fù)合模式陰離子層析圖譜


表1.jpg

表1：復(fù)合模式陰離子工藝數(shù)據(jù)


小結(jié)：SEC 結(jié)果顯示，抗體的聚集體含量由 6.55% 下降到了 0.44%。流穿模式下，聚集體去除效果明顯，同時(shí)該案例也表現(xiàn)出優(yōu)異的酸峰去除能力。



復(fù)合模式陽(yáng)離子MaXtar? MMC HR:

通過(guò)結(jié)合模式去除聚集體


MaXtar? MMC HR是一款復(fù)合模式弱陽(yáng)離子填料，粒徑 40 μm，用于抗體的精細(xì)純化，可以達(dá)到去除聚集體、電荷異構(gòu)體、降解片段等多種雜質(zhì)。


案例一：雙抗案例（文獻(xiàn)引用1）


圖片2.png

圖3： MMC層析圖譜


圖片3.png

圖片4.png


小結(jié)：SEC 結(jié)果顯示，雙抗的聚集體含量由 9.6% 下降到了 1.2%。電泳圖顯示，除聚集體外，輕鏈缺失的降解片段同樣具有很好的去除效果。



案例二：?jiǎn)慰拱咐?/strong>


測(cè)試條件：

  • 層析填料：MaXtar? MMC HR

  • 樣品：?jiǎn)慰箻悠?(15 mg/ml)

  • Buffer A：50mM NaAc-HAc ，pH 5.5

  • Buffer B：20 mM PB，0.5M NaCl，pH 7.0


表2.jpg

表2：MaXtar? MMC HR工藝數(shù)據(jù)


小結(jié)： 結(jié)果表明MaXtar? MMC HR對(duì)聚體和片段去除效果明顯。



工藝優(yōu)化建議:

  • 復(fù)合陰離子在抗體純化中多使用流穿摸索。而在層析工藝中，回收率和純度的平衡是我們優(yōu)化的主要考慮因素。在流穿條件下，上樣條件格外重要，通過(guò)調(diào)整上樣pH、上樣電導(dǎo)、上樣量這三個(gè)關(guān)鍵因素，借助DoE的手段，來(lái)尋找到最佳的實(shí)驗(yàn)條件。


  • 復(fù)合陽(yáng)離子層析，工藝開(kāi)發(fā)初期，可以嘗試單純的鹽濃度洗脫，如果樣品無(wú)法有效洗脫，建議pH線性和鹽/pH雙梯度洗脫，找到能夠有效洗脫的工藝參數(shù)。


參考文獻(xiàn)：

1、Yan Wan,Ting Zhang, Yumeng Wang, Ying Wang, Yifeng Li,Removing light chain-missing byproducts and aggregates by Capto MMC ImpRes mixed-mode chromatography during the purification of two WuXiBody-based bispecific antibodies . Protein Expression and Purification 175 (2020) 105712


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