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炙手可熱的雙抗賽道，如何實(shí)現(xiàn)高效純化？

雙特異性抗體是一種能夠同時(shí)結(jié)合兩種不同抗原的抗體分子，跟單抗或混合使用兩個(gè)單抗相比，雙抗因?yàn)槠洫?dú)特的生物學(xué)機(jī)制，在抗腫瘤的臨床研究和臨床治療中顯示出特異性更高、靶向性更強(qiáng)的顯著優(yōu)勢(shì)。然而，雙抗復(fù)雜的表達(dá)體系和結(jié)構(gòu)多樣性也為其工藝實(shí)現(xiàn)帶來了巨大挑戰(zhàn)，尤其是其下游雜質(zhì)的去除方法。本文將詳細(xì)闡述雙抗的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及相應(yīng)雜質(zhì)，并針對(duì)雙抗下游純化工藝的難點(diǎn)給出百林科的解決方案。

2022年是全球雙抗步入收獲期的一年，4款雙抗在全球范圍內(nèi)獲批，數(shù)量超越了此前總和。隨著單抗各靶點(diǎn)不斷進(jìn)入紅海競(jìng)爭(zhēng)狀態(tài)，國內(nèi)藥企更是已經(jīng)意識(shí)到雙抗藥物的廣闊發(fā)展空間，研發(fā)熱情空前高漲。包括康方生物、百濟(jì)神州、信達(dá)生物、君實(shí)生物、宜明昂科、康寧杰瑞等創(chuàng)新藥企均在該領(lǐng)域發(fā)力。其中，康方生物的首款國產(chǎn)雙抗藥物卡度尼利單抗一鳴驚人，以亮眼的業(yè)績(jī)?yōu)闃I(yè)內(nèi)的雙抗研發(fā)信心注入了一劑強(qiáng)心針。雙抗當(dāng)下儼然成為了生物醫(yī)藥界最炙手可熱的賽道。

由于其獨(dú)特的生物學(xué)機(jī)制，雙抗相比單抗在治療效果上具有明顯優(yōu)勢(shì)。但于此同時(shí)雙抗也存在諸多缺點(diǎn)，主要包括：

1、鏈錯(cuò)配（主要包括重鏈之間錯(cuò)配引起的同源抗體；輕鏈之間錯(cuò)配引起的異源抗體）

2、Fc片段引發(fā)的問題（Fc片段的存留與雙抗藥物的滲透性、半衰期、穩(wěn)定性、免疫原性等密切相關(guān)）

3、功能性、親和力、效價(jià)等（主要為非IgG-like問題）

此外，雙抗結(jié)構(gòu)可以被近一步分為雙價(jià)雙抗（ bivalent, 1+1），三價(jià)雙抗（trivalent, 1+2 或者2+1）和四價(jià)雙抗（tetravalent, 2+2）。雖然抗原配對(duì)價(jià)位的增加可以有效地提高雙抗的特異性和靶向性，但同時(shí)也給下游工藝開發(fā)帶來了前所未有的挑戰(zhàn)。雙抗純化的主要難點(diǎn)包括 1）雜質(zhì)組成極為復(fù)雜，除了常見的宿主細(xì)胞蛋白（host cell protein）和宿主細(xì)胞基因（host cell DNA），雙抗雜質(zhì)還包括各式各樣錯(cuò)配產(chǎn)物，抗體片段和聚合物；2）配錯(cuò)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上和物化特性上跟雙抗產(chǎn)物非常接近，極難去除；3）雜質(zhì)量大，錯(cuò)配產(chǎn)物最高可以達(dá)到總蛋白表達(dá)量的90%以上；4）比單抗相比，雙抗更容易發(fā)生聚合，尤其是抗體片段雙抗。

除了以上問題外，雙抗分為非對(duì)稱雙抗和對(duì)稱性雙抗，而根據(jù)是否含有Fc片段，非對(duì)稱雙抗又可以分為IgG-like和非IgG-like。對(duì)稱性雙抗C端加另一抗體的可變區(qū)。由于鏈延長(zhǎng)，最大的問題，聚集體含量會(huì)很高。根據(jù)目前發(fā)表的文獻(xiàn)，高達(dá)50%，而在二硫鍵設(shè)計(jì)，聚集體含量可降至20%；此外，非對(duì)稱性雙抗在表達(dá)過程中會(huì)產(chǎn)生多種副產(chǎn)物，主要分為同源二聚體，半抗，多聚體三類。根據(jù)不同的副產(chǎn)物純化工藝的選擇有所不同。

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圖1：雙抗純化流程圖

針對(duì)同源抗體和半抗可利用Protien A 層析分擔(dān)后續(xù)純化去出同源抗體和半抗的壓力。一般而言，同源二聚體很難去除，因?yàn)槠湮锢砘瘜W(xué)性質(zhì)都與目的雙抗相似。因此在分子設(shè)計(jì)上可以通過一些方法區(qū)分同源二聚體，如通過親和力差異性與電荷及疏水性差異來進(jìn)行純化。例如通過阻斷重鏈恒定區(qū)protein A結(jié)合位點(diǎn)的分子設(shè)計(jì)策略可以有效簡(jiǎn)化同源二聚體的去除。

圖2：可通過PH梯度洗脫達(dá)到同源二聚體的去除

產(chǎn)品的相關(guān)雜質(zhì)并不依賴這一步，捕獲階段主要對(duì)于工藝雜質(zhì)HCP、DNA的去除，或保證產(chǎn)品比較高的回收率。但針對(duì)雙抗副產(chǎn)物比較多的這個(gè)情況，我們也是希望讓Protein A承擔(dān)一些的責(zé)任，減輕下游去除這些副產(chǎn)物的壓力。

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圖3：通過條件優(yōu)化，達(dá)到去除半抗的效果

百林科MaXtar ARPA的配基是修飾的耐堿rProtien A，可耐受0.5M NaOH進(jìn)行CIP，具有高流速，高載量的特性，動(dòng)態(tài)載量>60mg/ml。

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圖4：0.5 M NaOH 分別處理0h、12h、24h、48 h處理后MaXtar ARPA動(dòng)態(tài)結(jié)合載量均能夠維持40 mg/ml以上，且仍可以保持80%以上的初始載量水平。

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圖5：MaXtar ARPA運(yùn)行200個(gè)cycle以后，DBC>90%

層析柱：4.7ml（柱高10cm）

樣品：人血來源的IgG，6mg/ml

保留時(shí)間：上樣階段6min，其余4min

CIP：0.5M NaOH，15min

測(cè)試次數(shù)：220次

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圖6：MaXtar ARPA動(dòng)態(tài)結(jié)合載量RSD小于5%

MaXtar ARPA

在雙抗項(xiàng)目中的表現(xiàn)

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圖7: 在收率相當(dāng)?shù)那闆r下SEC-HPLC結(jié)果顯示， MaXtar ARPA與某進(jìn)口品牌無明顯差異

此外，羥基磷灰石CHT在雙抗純化中對(duì)與半抗和多聚體的去除擁有良好的表現(xiàn)，對(duì)于聚集體不能控制在較低水平的情況，使用BaronCHT type Ⅱ開發(fā)可以起到很好的效果，百林科提供高質(zhì)量的Ⅰ和Ⅱ型羥基磷灰石。 640 (3).jpg

圖8：百林科羥基磷灰石球體形貌和晶體結(jié)構(gòu)

參考文獻(xiàn)

Bent W., et al., Development of a single-step, protein A chromatography process for bispecific antibodies in early screening. Summlt.

Source：Y.Li., A brief introduction of IgG-like bispecific antibody purification: Methods for removing product-related impurities, Protein Expression and Purification (2019)

Yifeng Li, Ying Wang, Peter (Keqiang) Shen, Weichang Zhou ,A roadmap for IgG-like bispeci?c antibody puri?cation

Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies

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